La chiesa fu edificata nel 342 da Costanza, figlia di Costantino il Grande, sulle catacombe in cui la santa era stata sepolta e accanto alle quali aveva fatto costruire il suo mausoleo.
L'interno è a tre navate, divise da colonne antiche, precedute da un nartece e sormontate da un matroneo. I due piani di portici sono formati ciascuno da quattordici colonne corinzie di forme e marmi diversi. La navata centrale, con finestre ad arco a tutto sesto, è coperta da un soffitto ligneo a cassettoni, riccamente decorato nel 1606. Nella seconda cappella a destra si trova un dittico marmoreo con i santi Stefano e Lorenzo, realizzato da Andrea Bregno. Nell'abside mosaico con la figura di S.Agnese risalente ai tempi di Onorio I, uno dei più alti esempi di arte bizantina a Roma. L'affresco sopra l'arcone dell'abside è di Pietro Gagliardi, le sante sulle pareti laterali sono di Domenico Toietti.
All'interno della basilica si accede alle catacombe, risalenti al periodo dal II al IV secolo
